Diego Souza iniciou sua carreira no Fluminense, em 2003. Com passagens por todas as categorias de base da seleção brasileira, o meia fez parte do elenco que foi campeão carioca de 2005. Jogou pouco mais de um ano pelo clube e se transferiu para o Benfica, de Portugal, mas a saudade bateu e optou por seu retorno ao país de origem. Após alguns meses na Europa, foi emprestado ao Flamengo no ano seguinte e ajudou o time a se livrar do rebaixamento. Em excelente fase técnica e física no final de 2006, desembarcou em Porto Alegre para vestir a camisa do Grêmio, transformando-se em um dos principais jogadores da equipe campeã gaúcha de 2007 e vice-campeã da Libertadores. No início de 2008, já vestia a camisa do Palmeiras, de Vanderlei Luxemburgo.  Após três temporadas, transferiu-se para o Atlético-MG. Já no Vasco em 2011, conquistou a Copa do Brasil. Ainda passou por Al Ittihad, Cruzeiro e Metalist, até ter duas passagens pelo Sport, entre elas um retorno rápido ao Fluminense. Em janeiro de 2018, foi anunciado como novo reforço do São Paulo. Após uma temporada, acabou emprestado para o Botafogo no ano seguinte. Até retornar ao Grêmio em 2020, exatos 13 anos depois. Foram mais cinco títulos pelo clube gaúcho até resolver reatar com um outro clube, o Sport, em julho de 2023. Até que, em fevereiro de 2024, após 20 anos de carreira, anunciou sua aposentadoria dos gramados.